技術概述
Illumina定序是全球應用最廣泛的大規模平行定序（MPS）/次世代定序（NGS）技術。它是一種基於合成定序（SBS）化學的高通量DNA定序方法。此方法利用橋接PCR在流動槽上克隆擴增文庫，並支援單端或雙端定序。帶有索引的接頭允許在流動槽的單一通道上進行多重定序，從而實現高效且經濟的定序運行。這項技術可廣泛應用於基因組學、轉錄組學和表觀遺傳學研究。.
基因組學核心實驗室目前配備一台 NovaSeq X Plus 和一台 NovaSeq 6000 系統，這兩款都是先進的 Illumina 平台，旨在提供前所未有的通量和可擴展性。 NovaSeq X Plus 能夠以更高的速度和成本效益提供超高的資料輸出，是大型專案的理想選擇。此外，我們還擁有 MiSeq 定序儀，它支援需要快速資料傳輸或更長定序讀長的小型專案。憑藉最新的硬體和軟體配置，MiSeq 支援多種讀長，從 SE36 (1 x 36 bp) 到 PE300 (2 x 300 bp)。詳情請與我們聯絡。.
本中心提供Illumina定序的全套服務，包括文庫建置和定序運行。我們也提供預先建置文庫的定序運行服務。詳情請洽。.
應用：
下表總結了自 2012 年 4 月以來核心部門提供的服務。.
| 樣本類型 | 服務類型 |
| 脫氧核糖核酸 | 全基因組定序、人類外顯子定序、標靶富集定序、擴增子定序、宏基因體學、ChIP-seq、甲基化定序、16S rRNA定序等 |
| RNA | 轉錄組定序、小RNA譜分析及其他 |
服務費和訂購
服務收費
此核心實驗室提供全面的 NGS 服務，包括核酸萃取、文庫製備、NovaSeq/MiSeq 定序和生物資訊學服務。.
請聯絡郭欣醫生（ hinkwok.cpos@hku.hk / 2831-5483）或平台專家進行專案討論。.
價格受以下因素影響：
- 所需通量或覆蓋倍數（定序讀取或鹼基輸出）
- 讀取類型和長度（單端讀取或雙端讀取，50 bp 至 300 bp）
- 工作類型（DNA鳥槍法定序、RNA定序、小RNA定序、ChIP定序、宏基因體學等）
- 樣本數
- 樣品的GC含量
- 文庫製備方法
- 生物資訊分析需求
- 特殊和/或附加要求
- 附屬機構（香港大學、本地學者、海外學者和商業公司）
服務訂購
請透過以下方式提交服務請求 iLab.
技術細節
圖書館準備
我們提供多種文庫製備方案。根據應用程式需求，核心庫最多可提供 384 種索引組合。 [1] 我們提供文庫建置和定序服務。項目討論可提供免費諮詢。請聯絡我們以了解更多資訊。.
[1] 我們提供帶有唯一分子識別碼（UMI）的獨特雙索引。詳情請洽。.
定序運行
NovaSeq 6000 技術規格（來自 Illumina）：
| 閱讀長度 | SP流動池 | S1 流動池 | S2 流動池 | S4 流動池 | ||
| 單流池 | 單流池 | 單流池 | 單行道 | 單流池 （4條車道） | ||
| 2 x 50 bp ^ | 65 – 80 GB | 134 – 167 GB | 333 – 417 GB | 不適用 | 不適用 | |
| 2 x 100 bp ^ | 134 – 167 GB | 266 – 333 GB | 667 – 833 GB | 400 – 500 GB | 1600 – 2000 GB | |
| 2 x 150 bp | 200 – 250 GB | 400 – 500 GB | 1000 – 1250 GB | 600 – 750 GB | 2400 – 3000 GB | |
| 讀取通過過濾器 | 單端 | 650 – 800 米 | 1.3 – 1.6 B | 3.3 – 4.1 B | 2.0 – 2.5 B | 8.0 – 10.0 B |
| 雙端 | 1.3 – 1.6 B | 2.6 – 3.2 B | 6.6 – 8.2 B | 4.0 – 5.0 B | 16.0 – 20.0 B | |
| 品質評分* （v1.5 試劑盒） | ≥ 90%，Q30 以上鹼基位於 2 x 50 bp 處 | |||||
| ≥ 85%，Q30 以上鹼基在 2 x 100 bp 處的數量。 | ||||||
| ≥ 85%，Q30 以上鹼基位於 2 x 150 bp 處 |
NovaSeq X Plus 技術規格（取自 Illumina）：
| 閱讀長度 | 1.5B 流通池 | 10B 流通池 | 25B 流通池 | |||
| 單流池 | 單行道 | 單流池 （8條車道） | 單行道 | 單流池 （8條車道） | ||
| 2 x 50 bp ^ | 165 GB | 125 GB | 1 TB | 325 GB | 2.6 TB | |
| 2 x 100 bp ^ | 330 GB | 250 GB | 2TB | 660 GB | 5.3 太立方英尺 | |
| 2 x 150 bp | 500 GB | 375 GB | 3TB | 1 TB | 8TB | |
| 讀取通過過濾器 | 單端 | 16億 | 1.25億 | 10 B | 3.25 B | 26 B |
| 雙端 | 3.2 B | 2.5億 | 20 B | 6.5 B | 52 B | |
| 品質評分* | ≥ 90%，Q30 以上鹼基位於 2 x 50 bp 處 | |||||
| ≥ 85%，Q30 以上鹼基在 2 x 100 bp 處的數量。 | ||||||
| ≥ 85%，Q30 以上鹼基位於 2 x 150 bp 處 |
MiSeq 技術規格（來自 Illumina）：
| 閱讀長度 | MiSeq 試劑盒版本 | 輸出 | 讀取通過過濾器 | 品質* |
| 2 x 250 bp | v2 | 7.5 – 8.5 GB | 2400萬至3000萬條雙端定序讀段 | Q30 以上鹼基數大於 75% |
| 2 x 300 bp | v3 | 13.2 – 15 GB | 4400萬至5000萬條雙端定序讀段 | Q30 以上鹼基數大於 70% |
^核心實驗室常規使用NovaSeq定序，讀長為2 x 150bp。如需其他讀長，請諮詢。.
*安裝規範基於 Illumina PhiX 對照文庫，並採用支援的簇密度。性能可能因樣本品質、核苷酸多樣性、簇密度和其他實驗因素而異。即使添加了 PhiX，Illumina 也無法保證低多樣性文庫的 Q30 值和品質。.
工作流程
樣品要求及提交
A. 樣品製備
純淨的DNA和RNA對於確保文庫製備的一致性和數據品質至關重要。.
我們的建議：
- 使用柱純化
- 對於以苯酚/氯仿法純化的樣品，需進行管柱層析再純化。
- 用核糖核酸酶處理DNA
- 用DNase處理RNA
一般來說，樣品應符合以下要求：
- 不含抑制劑，例如血紅素（來自血液）、EDTA 和鹽類
- 不含任何有機溶劑，如苯酚、氯仿和乙醇
- 不含細胞碎片或蛋白質
- 溶於適當pH值的緩衝液中，例如pH 8.5的10mM Tris-HCl緩衝液。
- 未降解，即高分子量、雙股基因組DNA和RNA，在片段分析儀上有較高的RQN評分。
備註：對於使用 Illumina Nextera 試劑盒的項目，請確保初始 DNA 不含 EDTA，且不含苯酚、乙醇等有機污染物。這些物質會幹擾 Nextera 片段化反應，導致檢測失敗。.
樣品準備前，請聯絡平台專員確認樣品提交物流資訊。.
B. 樣品要求
DNA和RNA樣本在提交前均需以紫外線分光光度法進行純度和含量評估。部分基於DNA的應用還需要提供凝膠照片。.
樣品提交後，核心平台專家將對樣品進行品質控制，其中包括
- 使用 Qubit 對 DNA 和 RNA 樣本進行定量分析
- RNA 片段分析儀 RNA 品質評估（需付費）
請參考下表了解各申請項目的樣本提交要求，並提交樣本。 最小體積為 10 μL 在貼有清晰標籤的 1.5 mL 低吸附微型離心管中。.
| 定序類型 | 樣本類型 | 協定輸入 （基於量子位元值） | CPOS基因組學核心 最低金額要求* | 專注 | A260/280 | 問題^ | 凝膠照片 必需的 |
| DNA定序 | 脫氧核糖核酸 | 1 奈克 – 1 微克 | 200 奈克 – 1.5 微克 | >50 ng/μL | 1.8 – 2.0 | 不適用 | Y |
| 人類全外顯子定序（WES） | 基因組DNA | 0.5 – 1 微克 | 1.5微克 | >50 ng/μL | 1.8 – 2.0 | 不適用 | Y |
| ChIP-Seq | ChIP-DNA | 1 奈克 – 10 奈克 | 40 納克 | >5 ng/μL | 不適用 | 不適用 | Y |
| 人類全基因組定序（WGS） | 基因組DNA | 550 納克 | 1.5微克 | >60 ng/μL | 1.7 – 2.0 | 不適用 | Y |
| 全基因組亞硫酸氫鹽定序（WGBS） | 基因組DNA | 250 納克 | 1.5微克 | >50 ng/μL | 1.8 – 2.0 | 不適用 | Y |
| 簡化代表性亞硫酸氫鹽定序 (RRBS) | 基因組DNA | 100 納克 | 500 納克 | >50 ng/μL | 1.8 – 2.0 | 不適用 | Y |
| 去除 rRNA 的 RNA-Seq | 總RNA | 100 奈克 – 500 奈克 | 300 奈克 | >30 ng/μL | 1.8 – 2.2 | >=7 | N |
| Poly-A mRNA-Seq | 總RNA | 100 奈克 – 1 微克 | 300 奈克 | >30 ng/μL | 1.8 – 2.2 | >=7 | N |
| 小RNA定序/miRNA定序 | 總RNA | 100 奈克 – 500 奈克 | 300 奈克 | >30 ng/μL | 1.8 – 2.2 | >=7 | N |
* 我們請求的輸入量超過協議規定的量，原因有二：
（1）在建造文庫之前，我們需要額外的樣品進行品質控制。.
（2）我們注意到大多數使用者使用 OD 測量（例如 Nanodrop）來量化樣品，這在大多數情況下會高估 DNA/RNA 的數量。.
對於 RQN 低於 7 的 RNA 樣本，我們以往的經驗表明，即使品質較低，我們也能成功建立定序文庫。在這種情況下，我們將為您提供後續優化結果的建議。.
我們會妥善保管樣品，並將剩餘部分退還。.
如果您的樣品不符合上述要求，請與我們聯繫，我們可以一起尋找替代方案。.
C. 樣品提交
如需申請服務，請使用 iLab 請務必上傳與申請對應的已填寫完整的樣本提交表格。由於 CPOS 正在為 SS100 和 SS300 專案實施 Agilent SLIMS 系統，因此這兩個服務的表格都是專門客製化的。.
- 針對 SS100 服務（DNA-Seq 計畫）： 樣品提交表-SS100 （並將帶有合適分子量標記的DNA凝膠照片附在…上） iLab 工作）
- 針對 SS300 服務（RNA-Seq 計畫）： 樣品提交表-SS300
- 其他NGS服務： 樣品提交表
請 請提前聯繫我們的同事。 （透過電話/電子郵件）在您現場提交樣品之前。.
我們鼓勵使用者提交單管預混合文庫進行定序服務。每管提交的文庫或文庫混合物均需由核心實驗室進行文庫品質控制（QC）。這包括使用 Qubit 和 qPCR 進行定量分析，以及使用 Fragment Analyzer 進行片段大小分析。.
索引資訊應在文庫提交前發送至核心資料庫。請提供i5索引序列（如有），並保持其正向鏈方向。以下是… 指南 使用 BLAST 搜尋檢查索引序列方向。.
重要的提供錯誤的索引序列可能導致解復用失敗，並可能影響共享相同定序通道的其他文庫的讀段分配。在這種情況下，可能會收取額外費用。.
預製庫每管的一般提交要求：
| 定序平台 | NovaSeq X Plus | MiSeq |
| 文庫濃度（ng/μL），, 透過 Qubit 檢測法估算 | ≥ 2.5 | ≥ 2 |
| 文庫濃度（nM），, 透過QPCR檢測進行估計 | ≥ 5 | ≥ 5 |
| 體積（µL） | ≥ 15 µL，適用於 20-400 Gb 服務 對於大於 400 Gb 的服務，≥ 20 µL | ≥ 20 |
- 最佳文庫大小為 200 – 800 bp。.
- 無色，以 1.5mL 微量離心管包裝。.
- 免費 適配器二聚體污染.
- 實際所需數量可能取決於運行類型。如有圖書館難以滿足上述要求，請聯絡我們諮詢。.
請將資訊上傳至 iLab：
- 圖書館提交表格 （Excel格式的電子版）
- 官方圖書館準備規程
- 索引 i7 和 i5 序列
- 索引 i7 和 i5 序列，包含完整的接頭序列（如果使用客製化協議或客製訂購的適配器寡核苷酸)
提交前請諮詢平台專家。.
數據收集
概覽
資料可用後，使用者將收到電子郵件通知。有關資料託管的詳細信息，請參閱[此處應插入相關連結]。 CPOS生物資訊學核心 頁。.
服務條款
數據吞吐量
請參考 技術細節 供您參考。.
然而，實際吞吐量會受以下因素影響：
- 團簇密度
- 樣本中CG含量
- 試劑批
- 其他跑動變化
數據品質和可用性
我們將本著誠信原則，為所有合作者和使用者提供最佳的產出和高品質的數據。.
任何問題都將在跑步前、跑步過程中和跑步後公開討論。.
各階段的資料也可根據要求與合作者和使用者共用。.
週轉時間
| NovaSeq 6000 | MiSeq | ||
全方位服務：
| 2-4週 | 全方位服務：
| 2-3週 |
| 3-5週 | ||
| 按泳道定序服務 （每通道/每個流通單元） 僅定序的綜合服務 （與其他項目進行定序） | 1-3週 1-3週 | 僅定序服務 * （每個流動池） | 1-2週 |
週轉時間是從樣品通過我們的品質控制標準到交付結果的時間計算的。.
週轉時間適用於各種規模的項目。 樣本數量≤80個。如果專案規模>80個樣品，請聯絡我們以取得服務週轉時間資訊。80 個樣本。.
週轉時間僅在試劑庫存充足的情況下有效，否則需要額外幾週時間進行試劑訂購和交付。.
CPOS 願意協助研究人員進行研發專案並滿足緊急需求，請隨時與我們討論您的計畫。.
* MiSeq定序服務預設不會選擇接頭序列修剪。如果您需要接頭序列修剪，請在項目確認前提出。.
聯絡我們
郭欣醫生
馮女士，Joyce
