蛋白質樣品製備

蛋白質體學和代謝組學核心實驗室為細胞、組織和體液等生物樣本提供以下樣本製備服務。.

1. 樣本均質化（例如細胞和組織）
2. 還原、烷基化、消化（溶液內或凝膠內）和 C18 階段尖端淨化
3. 血清/血漿中高豐度蛋白的移除（Agilent MARS-14）
4. 同位素標記相對和絕對定量 (iTRAQ)、TMT 標記用於蛋白質鑑定和定量
5. 利用超高效液相層析法進行多維蛋白質和勝肽分離。

請注意：

• 我們僅為SILAC標記的蛋白質樣本提供下游LC-MS/MS分析。
• PMcore將根據專案需求決定選擇樣品製備服務。

蛋白質消化

凝膠內消化在考馬斯亮藍染色的凝膠上效果最佳。如果需要更高的靈敏度，也可以使用銀染或Sypro Ruby染色。進行銀染時，請務必使用… 質譜相容染色試劑盒. 銀染凝膠斑點應使用 1% 乙酸溶液進行處理。考馬斯亮藍或 Sypro Ruby 凝膠斑點可以乾樣（脫水）或使用脫色緩衝液處理（樣品可能會隨時間推移而略有損失）。請參閱樣品提交頁面，以了解如何處理和提交樣品進行分析的具體說明。我們標準的凝膠內和溶液內酶解方案包括半胱氨酸殘基的還原和烷基化，隨後進行胰蛋白酶酶解。如有需要，我們也可以進行其他酵素解，請直接聯絡我們討論可用的方案和價格。酶解後，使用 C18 管柱或離心過濾器將樣品純化和濃縮。.

請聯絡 PM Core pmcore.cpos@hku.hk 或致電 2831-5482 諮詢哪種方法適合您的研究，以及客製化您感興趣的化合物的質譜分析。價格和時間安排將根據分析的複雜程度而有所不同。.

蛋白質鑑定 – ESI-LC-MS/MS

工作流程

溶液內/凝膠內消化
蛋白質樣品用胰蛋白酶/Lys-C或兩者進行消化。.

液相層析-串聯質譜分析
蛋白質鑑定是在與 Orbitrap Fusion Lumos 質譜儀聯用的線上反相奈米液相層析儀上進行的。.

資料庫搜尋
使用 SEQUEST 搜尋引擎搜尋所獲得的 MS/MS 光譜，然後使用 Proteome Discoverer (PD) 軟體進一步驗證所得的蛋白質鑑定結果。.

在 PD 軟體中，應用補充統計分析來進一步驗證勝肽的鑑定結果，並協助數據解釋過程。.

結果交付
結果將以 PD 結果文件的形式交付給使用者。.

請建立一個帳戶 蛋白質體發現軟體網站 下載PD軟體的30天試用版。.

透過檢視器，您可以存取為您的樣品收集的所有原始 MS/MS 光譜，以及用於數據分析的所有參數的報告，以便進行潛在的發表。.

30天試用期結束後，試用版將僅作為輸出檔檢視器使用。.

發現蛋白質體學

1. 等壓標記 同位素標記法基於化學同位素摻入，使用具有相同化學結構和總質量的標籤。標籤在碎片化過程中釋放的不穩定部分（即報告離子）質量會發生變化，相對定量地基於這些報告離子的強度。同位素標記法可實現多重分析。 iTRAQ、串聯質譜標籤 (TMT)、ICAT 等。.
2. 代謝標記 – 利用胺基酸進行細胞培養的穩定同位素標記（SILAC）是指使用含有 13C 或 15N 標記胺基酸的培養基將同位素摻入細胞。相對定量是基於輕標記和重標記勝肽的強度。. （請注意，我們不提供細胞培養服務，但可以支持SILAC標記樣本的實驗設計和蛋白質體學分析。）). 矽酸.
3. 無標籤 此方法旨在測定兩個或多個生物樣本中蛋白質的相對含量。與其他蛋白質定量方法不同，無標記定量無需使用含有穩定同位素的化合物與蛋白質進行化學結合標記。無標記定量可以基於前驅訊號強度或光譜計數。光譜計數基於以下假設：特定蛋白質的MS/MS譜圖數量與其在樣品中的豐度成正比。光譜計數可用於在無需標記的情況下對複雜樣品中的蛋白質進行相對定量。

請注意:

• 對於這些實驗，我們建議對每個生物學重複樣本進行三次分析，以提高所測得的勝肽段（以及蛋白質）倍數變化的統計顯著性。此類實驗可擴展到其他研究，例如，研究蛋白質表現隨時間的變化（在外部刺激或基因敲除的情況下）。無標記差異表達分析僅適用於在串聯質譜（MS/MS）分析之前使用單維液相層析（LC）分離的情況。
• 探索性實驗和標靶實驗都非常耗時且耗力。這些方法的成功取決於週詳的計劃和選擇合適的樣品製備技術。